BN电泳样品制备试剂盒
产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
RTD8304 | BN电泳样品制备试剂盒 | 50-100次 |
● 产品包装：
货号 | 组份 | 规格 | 贮存 |
RTD8303-01 | 10% DDM | 1 ml | -20℃ |
RTD8303-02 | 5% Digitonin | 1 ml | -20℃ |
RTD8303-03 | 4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 10 ml | -20℃ |
RTD8303-04 | 5% G-250染料 | 1 ml | -20℃ |
● 产品简介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。
BN电泳样品制备试剂盒含有BN/CN电泳样品上样所需要的试剂，包括两种最常用的即用型非离子型去垢剂-DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）和Digitonin（毛地黄皂苷），这些去垢剂可以有效提高膜蛋白样品的溶解性，避免电泳中产生样品拖尾现象。
以每次处理100μl（10-20 μg/μl）样品计算，该试剂盒可以使用50-100次。
● 保存条件：
-20℃保存，一年有效。
● 使用说明：
一 用前必读：
1. 由于蛋白样品的多样性，不太可能提供一种通用的BN蛋白样品制备和上样程序。用户可以根据自己的样品种类和实验目的，适当调整实验程序，找到最适合的使用方法。
2. 10% DDM和5% Digtonin溶液常温溶化后如有沉淀，95℃加热5分钟至沉淀彻底溶解后使用。
3. BN电泳样品不能使用含SDS的上样缓冲液制备。
二 制备细胞器样品BN上样溶液：
以下程序用于提取好的细胞器样品的BN电泳检测，如线粒体和叶绿体样品。
2.1 取制备好的细胞器沉淀，冰浴溶化。
2.2 根据下表制备样品：
试剂 | 终浓度 | 备注 |
细胞器样品体积 | as you wish | BN电泳中每个泳道的蛋白上样量尽量控制在50 μg以内。样品上样液的浓度控制在2.5-5 μg/μl（上样体积10-20 μl）。使用者可以根据样品浓度适当调整。 |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 1× |
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10% DDM或5% Digitonin | 1% | 推荐使用的去垢剂终浓度为1%。很多样品可能需要优化去垢剂浓度。调整范围为0.5-5% DDM或0.5-2.5% Digitonin。 |
2.3 溶液冰浴处理15分钟，间歇混匀。
2.4 4℃ 20000 g离心30分钟。
2.5 取上清加入5% G-250染料，使其样品中G-250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。如使用终浓度1%去垢剂，样品中G-250终浓度为0.25%。如使用其他去垢剂终浓度，请调整G-250染料的加入体积。
三 制备细菌、组织或细胞BN上样溶液：
3.1 参考下表制备不同样品裂解物：
试剂或样品 | 操作或使用体积 | 终浓度 | 备注 |
E.coli | 取细菌菌液1-2 ml，加入上样缓冲液和去垢剂，冰浴超声处理（推荐30-50%功率，超声2秒，间隔3秒，超声2分钟） | - | 尽量取对数生长期细菌，OD600在0.6-1.0之间 |
培养细胞 | 1×107细胞加入上样缓冲液和去垢剂，用移液器吹打8-10次重悬细胞沉淀 | - |
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新鲜组织 | 10-50 mg新鲜组织加入上样缓冲液和去垢剂，用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次 | - |
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4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 125 μl | 1× |
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10% DDM或5% Digitonin | 50 μl 或100 μl | 1% | 推荐使用的去垢剂终浓度为1%。很多样品可能需要优化去垢剂浓度。调整范围为0.5-5% DDM或0.5-2.5% Digitonin。 |
灭菌水 | 定容至500 μl |
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3.2 裂解物冰浴处理15分钟，间歇混匀。
注：某些样品裂解后会释放出大量核酸，使得裂解后的样品比较粘稠，可以加入DNase消化核酸（货号：RTT2103）。
3.3 4℃ 20000 g离心30分钟。
2.4 取上清加入5% G-250染料，使其样品中G-250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。如使用终浓度1%去垢剂，样品中G-250终浓度为0.25%。如使用其他去垢剂终浓度，请调整G-250染料的加入体积。
四 样品检测：
蛋白电泳可以选择Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（货号：RTD6139）进行检测；电泳后凝胶染色可以使用FastBlue蛋白染色液（货号：RTD6202）；电泳后凝胶的转膜可以使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。
