RealPAGE plus彩色凝胶快速制备试剂盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 货品规格：
货号 | 说明 | 制胶数量 |
RTD6132-06 | 制备6%PAGE胶 | 125块 0.75mm胶 ＞90块1 mm胶 ＞60块1.5 mm胶 |
RTD6132-08 | 制备8%PAGE胶 | |
RTD6132-10 | 制备10%PAGE胶 | |
RTD6132-12 | 制备12%PAGE胶 | |
RTD6132-15 | 制备15%PAGE胶 |
● 货品内容：
组份 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存 |
1 | RTD6132-UA | 上层胶溶液A | 80 ml | 4℃ |
2 | RTD6132-UB | 彩色上层胶溶液B | 80 ml | 4℃ |
3 | RTD6132-LA06 | 下层胶溶液A 6% | 250 ml | 4℃ |
RTD6132-LA08 | 下层胶溶液A 8% | 250 ml | 4℃ | |
RTD6132-LA10 | 下层胶溶液A 10% | 250 ml | 4℃ | |
RTD6132-LA12 | 下层胶溶液A 12% | 250 ml | 4℃ | |
RTD6132-LA15 | 下层胶溶液A 15% | 250 ml | 4℃ | |
4 | RTD6132-LB | 下层胶溶液B | 250 ml | 4℃ |
5 | RTD6132-SP | 改良型促凝剂 | 8 ml | 4℃，配制后-20℃贮存 |
|
| 说明书 | 一份 |
|
● 产品简介：
该产品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，可在50分钟内配制得到高质量的聚丙烯酰胺凝胶，用于变性和非变性蛋白凝胶电泳。本产品可以配制常用分离胶浓度6%、8%、10%、12%和15%，可以满足绝大多数蛋白电泳需求。
本试剂盒大约可以配制60-125块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制125块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少90块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少60块胶。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。
● 特点：
1. 方便：彩色上层胶，方便上样；上层胶和下层胶溶液1:1混合，无需计算；
2. 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加TEMED；
3. 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）；
● 使用说明：
一 凝胶制备：
1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2 根据下表参考选择合适的凝胶浓度
表一不同浓度的PAGE下层胶的最佳分离范围
下层胶（分离胶）浓度 | 最佳分离范围 |
6% | 50-350 kD |
8% | 35-300 kD |
10% | 20-150 kD |
12% | 15-100 kD |
15% | 10-80 kD |
1.3 根据下表配制凝胶：
表二 凝胶配制表
下层胶配方 | 上层胶配方 | ||||||
胶厚度 | 下层胶溶液B | 下层胶溶液A | 改良型促凝剂 | 胶厚度 | 彩色上层胶溶液B | 上层胶溶液A | 改良型促凝剂 |
0.75 mm | 2 ml | 2 ml | 40 μl | 0.75 mm | 0.5 ml | 0.5 ml | 10 μl |
1.0 mm | 2.5 ml | 2.5 ml | 50 μl | 1.0 mm | 0.75 ml | 0.75 ml | 15 μl |
1.5 mm | 4 ml | 4 ml | 80 μl | 1.5 mm | 1 ml | 1 ml | 20 μl |
1.3.1 取等体积下层胶溶液B 和下层胶溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混匀；
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝剂，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可；
注意：此溶液为过量，请勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃板缓慢加入适量灭菌水或无水乙醇覆盖于下层胶之上，待下层胶凝固后，倒去上层水或乙醇；
注意：当水（乙醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；25℃时5-10分钟可以聚合。
1.3.4 取等体积彩色上层胶溶液B和上层胶溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混匀；
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝剂，轻轻混匀，插入梳齿；
1.3.6 待上层胶凝固后 （约20-40 min），拔去梳齿即可用于电泳。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。
上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合；18℃ 35-40分钟可以聚合。
二 电泳：
2.1 SDS-PAGE变性电泳：
2.1.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.1.2 样品处理：融化-混合-变性-上样
5×MonoColor蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5-10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。
2.1.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
表三 SDS-PAGE电泳条件
恒电压 | 起始电流（一板胶） | 结束电流（一板胶） | 电泳时间 | 适用条件 |
150V | 35-40 mA | 15-20 mA | 55 + min | 最佳电压，最优的分辨率 |
200V | 45-55 mA | 20-25 mA | 45+ min | 节省时间 |
225V | 40-50 mA | 15-20 mA | 35+ min | |
250V | 65-75 mA | 20-25 mA | 30+ min | |
300V | 70-80 mA | 25-35mA | 25+ min | 最省时间 |
2.2 非变性电泳（Native PAGE）：
2.2.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.2.2 样品处理：融化-混合-上样
5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。
2.2.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
表四 Native PAGE电泳条件
| 恒电压 | 起始电流 | 结束电流 | 电泳时间 | 适用条件 |
推荐电压 | 150V | 25-35/板胶 | 5-10 mA/板胶 | 60 + min | 最佳电压，最优的分辨率 |
三. 染色：
1. 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
2. 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
3. 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4. 观察保存结果。
四. 实验示例：
