6%Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒（变性电泳，手灌胶）
货号 | 名称 | 规格 |
RTD6162 | 6%Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒（变性电泳，手灌胶） | 10次 |
● 产品组成：
货号 | 名称 | 规格 | 贮存 |
RTD6162-UA | 上层胶溶液A | 15 ml | 4℃ |
RTD6162-UB | 彩色上层胶溶液B | 15 ml | 4℃ |
RTD6162-LA06 | 下层胶溶液A 6% | 30 ml | 4℃ |
RTD6162-LB | 下层胶溶液B | 30 ml | 4℃ |
TA1510 | 400×抗氧化剂 | 15 ml | 4℃ (配制后-20℃贮存) |
TA050 | 10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液(变性电泳,溶液型） | 500 ml | RT |
PL080-01 | 5×MonoClolor蛋白上样缓冲液 (变性，还原) | 1 ml | -20℃ |
RTD6202-02 | FastBlue蛋白快速染色液 | 500 ml | RT |
TA5030P | 10×Tris-醋酸转膜缓冲液（湿转，粉末型） | 500 ml | RT |
AP020P | 10% APS（干粉） | 5 ml | RT (配制后-20℃贮存) |
TA0761-01 | TEMED | 0.5 ml | 4℃ 避光 |
| 说明书 | 一份 | - |
● 产品简介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝胶电泳适合于分离高分子量蛋白，可以有效分离50-500 kD范围内蛋白；电泳体系呈中性，能有效提高蛋白的稳定性；电泳缓冲体系中加入抗氧化剂，整个电泳过程都在还原条件下进行，有效防止二硫键的形成。
该试剂盒包含凝胶制备、蛋白上样、蛋白电泳、蛋白染色及转膜所需的全部试剂。试剂盒配套的制胶溶液，可以配制10板厚度1mm凝胶（面积8×10 cm），分离胶浓度为6%，可以有效分离50-500 kD范围内蛋白。配好的凝胶浓缩胶为红色，方便上样。本试剂盒用于蛋白变性还原电泳，不适用于蛋白非变性电泳。
按照一次实验电泳一板凝胶计算，本试剂盒可以使用10次。
● 贮存、运输及效期：
按照标签温度贮存；试剂盒常温运输；有效期一年。
● 使用说明：
一. 实验准备：
1.1 10%APS为干粉，用前加入5 ml超纯水震荡彻底溶解，适量分装后取一管使用。溶解后的APS -20℃贮存。
1.2 400×抗氧化剂为干粉，用前加入15 ml超纯水震荡彻底溶解后使用，已经溶解的400×抗氧化剂-20℃贮存。
二. 凝胶配制：
2.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2.2 根据下表配制凝胶：
下层胶配方 | 上层胶配方 | ||||||||
胶厚度 | 下层胶溶液B | 下层胶溶液A | 10%APS | TEMED | 胶厚度 | 彩色上层胶溶液B | 上层胶溶液A | 10%APS | TEMED |
0.75 mm | 2 ml | 2 ml | 40 μl | 4 μl | 0.75 mm | 0.5 ml | 0.5 ml | 10 μl | 1 μl |
1.0 mm | 2.5 ml | 2.5 ml | 50 μl | 5 μl | 1.0 mm | 0.75 ml | 0.75 ml | 15 μl | 1.5 μl |
1.5 mm | 4 ml | 4 ml | 80 μl | 8 μl | 1.5 mm | 1 ml | 1 ml | 20 μl | 2 μl |
2.2.1 取等体积下层胶溶液B 和下层胶溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混匀；
2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的10%APS和4/5/8 μl的TEMED，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可；
注意：此溶液为过量，请勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃板缓慢加入适量灭菌水或无水乙醇覆盖于下层胶之上，待下层胶凝固后，倒去上层水或乙醇；
注意：当水（乙醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；25℃时10-15分钟可以聚合。
2.2.4 取等体积彩色上层胶溶液B和上层胶溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混匀；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的10%APS和1/1.5/2 μl 的TEMED，轻轻混匀，插入梳齿；
2.2.6 待上层胶凝固后 （约20-40 min），拔去梳齿即可用于电泳。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。
上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合；18℃ 35-40分钟可以聚合。
三. 电泳：
3.1 准备1×电泳缓冲液：
总体积 | 1000 ml |
10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液 | 100 ml |
超纯水 | 900 ml |
3.1.1 外槽缓冲液：取适量体积1×电泳缓冲液用于外槽缓冲液。
3.1.2 内槽缓冲液：200 ml 1×电泳缓冲液中加0.5 ml 400×抗氧化剂，混合均匀后用于内槽缓冲液。
3.2准备上样样品：
注：表格以配制10 μl样品为例，其他体积按照比例调整。
| 总体积10 μl |
组份 | 还原样品 |
蛋白样品 | x μl |
5×MonoClolor蛋白上样缓冲液 (变性，还原) | 2 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 95℃ 10分钟 |
3.3电泳过程；
在电泳槽的内槽加入内槽缓冲液（已加入抗氧化剂），让电泳缓冲液漫过加样孔，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次；随后在电泳槽外槽加入适量的外槽缓冲液（不用添加抗氧化剂）。上样，电泳。
恒电压 | 起始电流 | 结束电流 | 电泳时间 |
200 V | 65-75 mA/板胶 | 35-55 mA/板胶 | 50+min |
注：冰浴电泳（可选） | |||
四. 染色：
注：如果只是观察蛋白的分离情况，对凝胶进行染色。如果要后续进行WB实验，凝胶不要染色，进行步骤五。
4.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），摇床常温摇动，条带5-10分钟即可见（蛋白含量高于1 μg条带）。
4.2 摇床常温继续摇动15-30分钟至条带清晰可见。
4.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4.4 观察保存结果。
五. 转膜：
5.1 转印膜选择：
Tris-醋酸凝胶转膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要选择0.45 μm孔径。PVDF膜使用前注意需要用甲醇润湿活化。
5.2 10×Tris-醋酸转膜缓冲液（溶液型）配制：
将10×Tris-醋酸转膜缓冲液（湿转，粉末型）粉末溶解于500 ml超纯水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸转膜缓冲液（溶液型），不要调节pH，pH~7.2。
5.3 准备1×转膜缓冲液：
|
| 1×即用型转膜缓冲液 配制量 1升 |
| 10×Tris-醋酸转膜缓冲液(溶液型) | 100 ml |
20-80 kD蛋白 | 无水甲醇 | 10% |
SDS | 0.05% | |
＞80 kD蛋白 | 无水甲醇 | 10%（NC膜） 0-5%（PVDF膜） |
SDS | 0.1% | |
| 超纯水 | 定容至1升，不要调节pH，pH~7.2 |
注：甲醇和SDS在转膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加结合在膜上，而SDS让蛋白更加离开膜。因此对大蛋白转膜来说，多加SDS，少加甲醇；而对小蛋白转膜，多加甲醇，少加SDS。
5.4 转膜条件：
高分子量蛋白建议湿转。以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。
膜孔径 | 蛋白大小 | 稳流 | 建议时间 | 降温措施 |
0.45 μm | 50-200 kD | 350 mA | ~60分钟 | 需要 |
0.45 μm | 高于200 kD | 350 mA | ~2-3小时 | 需要 |
六. 实验示例：
凝胶：6%Tris醋酸手灌胶
电泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；内槽加抗氧化剂
染色：FastBlue蛋白染色液染色 15 分钟
样品：4K-BME-细菌裂解物；K562-悬浮细胞RIPA提取总蛋白
