蛋白PAGE凝胶快速制备试剂盒（红色上层胶）
货号 | 说明 | 规格 |
RTD6133 | 蛋白PAGE凝胶快速制备试剂盒（红色上层胶） | 45-90板胶 |
Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit （Red Stacking Gel）
● 货品内容：
组份 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存 |
1 | AC2914-01 | 40%PAA（29：1） | 100 ml | 4℃ |
2 | RTD6133-UA | 红色上层胶溶液A（2×） | 50 ml | 4℃ |
3 | RTD6133-LB | 下层胶溶液B（2×） | 180 ml | 4℃ |
4 | RTD6133-SP | 改良型促凝剂 | 8 ml | 4℃，配制后-20℃贮存 |
5 | 1018210CM | 1.0 mm玻璃板/梳子套装 | 2套 | RT |
6 |
| 说明书 |
| - |
● 产品简介：
该产品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，可在30-50分钟内配制得到高质量的聚丙烯酰胺凝胶，用于变性和非变性蛋白凝胶电泳。本产品可以配制常用下层胶浓度6%、8%、10%、12%和15%，可以满足绝大多数蛋白电泳需求。
本试剂盒可配制45-90块常规大小（8×10cm）的PAGE胶，具体凝胶数量和凝胶浓度、厚度以及凝胶的大小有关。按照10%凝胶，大小8×10cm，可以配置0.75 mm厚度凝胶约90板，1.0 mm厚度凝胶约68板，1.5 mm厚度凝胶约45板。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。
● 特点：
1. 方便：红色上层胶，方便上样；
2. 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加TEMED；
3. 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）；
4. 配备1.0 mm厚度玻璃板和电泳梳子，方便实验。
● 使用说明：
一 凝胶制备：
1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2 根据下表参考选择合适的凝胶浓度：
下层胶（下层胶）浓度 | 最佳分离范围 |
6% | 50-350 kD |
8% | 35-300 kD |
10% | 20-150 kD |
12% | 15-100 kD |
15% | 10-80 kD |
1.3配制一块常用凝胶(10×8 cm)所需下层胶和上层胶体积(下层胶按6厘米高度计算，上层胶按1.5厘米高度计算，均含约0.2 ml的冗余量)参见下表。
凝胶厚度 | 下层胶体积 | 上层胶体积 |
0.75 mm | 4.0 ml | 1.0 ml |
1.0 mm | 5.0 ml | 1.5 ml |
1.5 mm | 8.0 ml | 2.0 ml |
注：下层胶体积已包含适量冗余，请勿全部用于灌制下层胶，以免灌胶时上层胶高度不够。
1.4配制下层胶：
参考下表，配制不同浓度的下层胶。适当混匀后倒入到制胶模具中，用蒸馏水或异丙醇或无水乙醇封住液面，直至下层胶凝固充分后再进行PAGE上层胶的配制。通常25℃ 10-40分钟内下层胶会凝固。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。上层胶25℃ 10-15分钟可以聚合凝固；18℃ 35-40分钟可以聚合凝固。
组份 | 不同凝胶体积对应各组份的取样量（ml） | |||
6％ 胶 | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml |
H2O | 1.7 | 3.4 | 5.1 | 6.8 |
下层胶溶液B（2×） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 |
40％ PAA（29:1） | 0.75 | 1.5 | 2.25 | 3.0 |
改良型促凝剂 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 |
8％ 胶 | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml |
H2O | 1.45 | 2.9 | 4.35 | 5.8 |
下层胶溶液B（2×） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 |
40％ PAA（29:1） | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
改良型促凝剂 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 |
10％ 胶 | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml |
H2O | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 |
下层胶溶液B（2×） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 |
40％ PAA（29:1） | 1.25 | 2.5 | 3.75 | 5.0 |
改良型促凝剂 | 0.05 | 0.1 | 0.1 | 0.2 |
12％ 胶 | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml |
H2O | 0.95 | 1.9 | 2.85 | 3.8 |
下层胶溶液B（2×） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 |
40％ PAA（29:1） | 1.5 | 3.0 | 4.5 | 6.0 |
改良型促凝剂 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 |
15％ 胶 | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml |
H2O | 0.575 | 1.15 | 1.725 | 2.3 |
下层胶溶液B（2×） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 |
40％ PAA（29:1） | 1.875 | 3.75 | 5.625 | 7.5 |
改良型促凝剂 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 |
1.5配制上层胶：
按照如下表格配制4% PAGE上层胶。下层胶灌注后，去除压胶溶液，配制好的上层胶紧贴玻璃板均匀轻柔注入到下层胶上，小心插入梳子等待凝固。
组份 | 不同凝胶体积对应各组份的取样量（ml） | |||
4％上层胶（上层胶） | 2 ml | 4 ml | 6 ml | 8 ml |
H2O | 0.78 | 1.56 | 2.34 | 3.12 |
红色上层胶溶液A（2×） | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
40％ PAA（29:1） | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
改良型促凝剂 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 |
注：红色上层胶缓冲液(2×)使用前须摇匀。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。
上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合凝固；18℃ 35-40分钟可以聚合凝固。
二 电泳：
2.1 SDS-PAGE变性电泳：
2.1.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.1.2 样品处理：融化-混合-变性-上样
5×蛋白上样缓冲液（变性，还原）常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5-10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。
2.1.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
SDS-PAGE电泳条件
恒电压 | 起始电流（一板胶） | 结束电流（一板胶） | 电泳时间 | 适用条件 |
150V | 35-40 mA | 15-20 mA | 55 + min | 最佳电压，最优的分辨率 |
200V | 45-55 mA | 20-25 mA | 45+ min | 节省时间 |
225V | 40-50 mA | 15-20 mA | 35+ min | |
250V | 65-75 mA | 20-25 mA | 30+ min | |
300V | 70-80 mA | 25-35mA | 25+ min | 最省时间 |
2.2 非变性电泳（Native PAGE）：
2.2.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.2.2 样品处理：融化-混合-上样
5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。
2.2.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
Native PAGE电泳条件
| 恒电压 | 起始电流 | 结束电流 | 电泳时间 | 适用条件 |
推荐电压 | 150V | 25-35/板胶 | 5-10 mA/板胶 | 60 + min | 最佳电压，最优的分辨率 |
三. 染色：
1. 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
2. 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
3. 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4. 观察保存结果。
